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samedi 1 décembre 2018

PCR Polymerase Chain Reaction

PCR Polymerase Chain Reaction 

Définition et Principe:
Moyen Test diagnostique de Biologie moléculaire très utilisé depuis son avènement en 1983, la  PCR (Polymerase Chain Reaction) son principe en biochimie consiste à synthétiser en grande quantité de courts fragments d’ADN, nommés amplicons, grâce à la capacité des polymérases de recopier un brin d’ADN par complémentarité des bases nucléotidiques.
Sensible et spécifique, elle a supplanté les techniques plus longues ou de performance médiocre, a fortiori pour les micro-organismes non ou difficilement cultivables.
Aujourd’hui, c’est un outil du quotidien pour tester une présomption clinique d’infection.

INDICATIONS
PCR test steps principe adn amplification biology coursesPCR en temps réel
• Quantification des charges virales (en nombre de copies)
• Génotypage d’espèces
• Détection de mutations de résistance aux anti-infectieux
PCR intégrée
• Urgences
• Biologie délocalisée
PCR multiplex
• Infections respiratoires
• Infections digestives
• IST
• Infections du système nerveux central...


Techniques:
La PCR en temps réel combine dans une même réaction amplification et détection, grâce à des sondes spécifiques marquées (de type TaqMan ou autres) automate; ces dernières émettent un signal de fluorescence d’intensité proportionnelle à la quantité d’amplicons formés, qui est converti en nombre de copies.
Grâce à cette propriété de quantification, les PCR en temps réel ont introduit la notion de seuil clinique et thérapeutique. En virologie, elles sont principalement indiquées dans le domaine de la prévention des maladies opportunistes (ex : détermination de la charge virale EBV pour la détection précoce des lymphoproliférations post-transplantation), la mise en place et  la surveillance des thérapies anti-infectieuses (ex : mesure de la charge VIH).
Récemment, la miniaturisation des systèmes de détection et les progrès de la micro-fluidique (autorisant des analyses dans des puces micrométriques) ont donné naissance à une nouvelle génération d’appareils de PCR dite « intégrée », dédiée à l’urgence. Ne nécessitant pas de  formation en biologie moléculaire, ces petites machines sont utilisables dans des postes de soins, des structures de biologie délocalisées (hôpital ou cabinet). Elles permettent notamment d’identifier les entérovirus et les Herpes simplex virus 1 et 2 à partir du LCR (sans étape d’extraction des acides nucléiques), les virus de la grippe et le virus respiratoire syncytial à partir d’un écouvillon nasopharyngé, ou encore le streptocoque B dans un prélèvement vaginal lors de l’accouchement, et ce en 1 à 2 heures.
Les PCR universelles visent à élargir au maximum l’analyse moléculaire à un ensemble de pathogènes partageant au moins un gène. C’est le cas de la PCR amplifiant le gène de l’ARN ribosomal 16S commun à l’ensemble des bactéries, rendant possible la mise en évidence de souches à croissance diffi cile ou dont la prolifération est inhibée par une antibiothérapie au moment du prélèvement.

C’est dans cette même optique de diagnostic étiologique global, qu’ont été conçues
les PCR multiplex résultats en moins de 6 heures (48 heures avec les méthodes classiques).
Elles offrent la possibilité de détecter jusqu’à 30 pathogènes différents à partir d’un même échantillon, et ce simultanément au cours d’une même réaction. Selon la méthode, les amplicons  sont identifiés soit en fonction de leur taille, soit par des sondes d’hybridation fluorescentes de différentes longueurs d’onde ou encore par capture sur des puces à ADN.

Certaines techniques (Luminex xTAG Technology) reposent sur l’immobilisation spécifique des amplicons sur des microbilles portant chacune une fluorescence différente, qui sont analysées  par un laser à très haut débit. `
Enfin, les tout derniers appareils, dans lesquels la PCR est suivie d’une ionisation par électronébulisation et spectrométrie de masse (ESI TOF MS, Plex ID, Abbott), sont en passe d’identifier les génomes de plus de 6000 bactéries, 2000 champignons et de milliers de  séquences virales dans un même échantillon.
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